Dois anos se passaram desde que o tranqüilo Peter Parker (Tobey Maguire) separou-se do grande amor de sua vida, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), e decidiu assumir o compromisso e a responsabilidade de seguir sendo o Homem-Aranha. Peter enfrenta novos desafios enquanto aprende a lidar com "seu dom e sua maldição", tentando desesperadamente harmonizar suas duasidentidades: a do super-herói aracnídeo, o Homem-Aranha, e a do estudante universitário. Todas as pessoas que Peter mais ama passam a correr perigo quando ele enfrenta o poderoso vilão cheio de tentáculos, o Doutor Octopus,também conhecido como "Doc Ock" (Alfred Molina).O eterno amor que Peter sente por M.J. se torna ainda mais forte à medida que ele luta contra o impulso de abandonar sua vida secreta e declarar seu amor. Enquanto isso, M.J. seguiu com sua vida. Ela se dedica à sua carreira artística e tem um novo par romântico. A grande amizade de Peter e Harry Osborn (James Franco) se complica diante da amargura do jovem Osborn.
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